PCR实验室核酸污染避坑指南《二、造成核酸污染的原因》

原因分类

1. 硬件

严格的PCR实验室应有标准的正负压系统及四分区（或三分区），实验室应按照生物安全二级实验室及PCR实验室设计基本要求来建设。可参考的标准为《GB50346-2011建设标准生物安全实验室建筑技术规范》及卫健委下发的《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》。标准实验室如下图：

医疗口的实验室大多符合要求，在科研口和农业口的实验室应重视实验室的规范性建设！软件配置应按照卫健委相关技术文件规定，人员配置应专区专人，人员不可不同分区混用，物流、人流、气流做到单向流动！

临床上，门诊的新冠快检PCR实验室（或免提取方法）多半不规范。没有严格按照标准PCR实验室建设，更加容易发生污染。三分区（或二分区）、缓冲间、正负压、人员配置2人以上，这些基本要求没有达到，更加容易发生气溶胶污染。

2. 生物安全柜

现有技术指导原则，只要求了选择BSL-Ⅱ级生物安全柜，但并未规定具体型号。从临床经验来看，只有B2型生物安全柜可以用于加核酸模板。

A1型、A2型、B1型，循环风很容易造成核酸气溶胶的形成，从而造成污染，且污染很难清除。B2型为全排放，无循环风，可以用于加核酸模板。

3.常见的消毒措施并不能有效降解核酸

紫外灯能杀灭病毒，但是《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》指出，短片段的基因核酸对紫外线损伤不敏感。

常规消毒剂如酒精、碘化物、戊二醛类、季铵盐等虽然能杀菌，但是不能降解核酸，或降解效率较差。

尤其是酒精，它其实是核酸提取试剂中的一个组分，对核酸没有任何降解作用。已知的消毒剂中，次氯酸盐类消毒剂可以一定程度的降解核酸，但是腐蚀性强，不能处理精密仪器及金属制品，容易腐蚀移液器吸杆影响tip头气密性。

4. 那些容易忽视的操作细节

吸取阳性对照（质粒）没有遵循“慢吸快打”的原则（这个需要练习形成“肌肉记忆”），新手往往是“快吸快打”，造成阳性样品污染枪头，或者在生物安全柜循环风的影响下，造成气溶胶飞溅，污染加样区域。应使用带有滤芯的枪头。

带滤芯枪头

4.2 加样区没有放置台面垃圾桶：应把加完样的tip枪头，丢入含有次氯酸溶液的加盖垃圾桶中。因为次氯酸容易挥发，因此应每天都要更换含氯消毒液！

5.污染高风险区域

在笔者的临床实践中，发现以下区域存在阳性污染的概率更大：

污染风险排行榜：

2区＞3区＞1区；

生物安全柜＞核酸提取仪＞移液器＞PCR扩增仪（PCR管密封性）＞离心机；

阳性质控品＞强阳性样本＞PCR扩增产物（无UNG技术）＞PCR扩增产物（UNG技术），PCR管密封性是扩增产物是否引起污染的关键。

如同，幸福的家庭都一样，不幸的家庭各有各的不幸。同理，规范的实验室都一样，污染的实验室各有各染情况。以上数据仅供参考。